Страницаиз16
СкороКнижный режим
Это бета-версия LiveLib. Сейчас доступна часть функций, остальные из основной версии будут добавляться постепенно.
В. П. Викторов, заведующий кафедрой Ботаники Биолого-химического факультета МПГУ, доктор биологических наук, профессор
М. В. Кондашевская, ведущий научный сотрудник лаборатории иммуноморфологии воспаления НИИ морфологии человека РАМН, доктор биологических наук, доцент
© Н. С. Стволинская, 2012
© Издательство «Прометей», 2012
В последние десятилетия цитология сделала большой рывок вперед в своем развитии и переросла в новое научное направление «клеточная биология», которое изучает молекулярные основы всех клеточных процессов и принципы их регуляции на молекулярном уровне. В связи с бурным развитием клеточной биологии пересмотрены и дополнены многие разделы классической цитологии, составляющей основу клеточной биологии.
В последние годы вышло несколько учебных пособий, отражающих отдельные разделы цитологии. Кроме того, издан объемный учебник «Введение в клеточную биологию» Ю. С. Ченцова, профессора МГУ им. М. В. Ломоносова, рассчитанный на годовой курс изучения дисциплины.
Переход на двухступенчатую систему высшего образования приводит к изменению учебного процесса. Бакалавры по направлению подготовки 050100.62 Педагогическое образование и 020400 Биология изучают цитологию в течение одного семестра первого курса. Данный учебник полностью соответствует государственному стандарту для бакалавров по указанному направлению и профилю образования университетов.
Учебник основан на классических представлениях цитологии, а также включает новые данные, полученные в этой области в последнее десятилетие, на основе которых к настоящему времени уже сформировались устоявшиеся представления.
В учебнике подробно изложены методы цитологии, включая самые современные, такие как иммуноцитохимия и конфокальная микроскопия. Рассматриваются в современном ракурсе понятия: дифференцировка, стволовые клетки, тотипотентность клеток. Весьма подробно и досконально разбирается тема «ядро», так как именно эта структура программирует работу клетки. Учитывая многолетний опыт преподавания и трудности усвоения этого материала студентами первого курса, автор предваряет тему «Ядро эукариотической клетки» главой «Химическая организация клетки», где в доступной форме излагаются представления о строении и функциях молекул ДНК и РНК, которые в дальнейшем будут занимать важное место в изложении темы «Ядро». Большое внимание в учебнике уделяется материалу по строению и функциям мембранных структур клетки, включая механизм работы рецепторов, рассмотрены строение и функции всех структур и органоидов клетки. Согласно государственному стандарту, в учебнике имеются главы, посвященные делению клетки и развитию половых клеток. Изложение учебного материала заканчивается главой «Патология клетки», в которой представлены современные взгляды на процессы некроза и апоптоза, их роль в патогенезе клетки, а также уделяется внимание биологии клеток злокачественных новообразований и современной теории, объясняющей причины возникновения опухолей.
Учебник заканчивается главой «Руководство к практическим занятиям по цитологии», где кратко изложен материал 18 практических занятий, перечислены микроскопические препараты и микрофотографии, используемые в изучаемом курсе. Завершается глава перечнем теоретических вопросов к зачету или экзамену по цитологии.
При изложении материала автор опирался на многолетний опыт преподавательской деятельности, обращая особое внимание на трудные разделы программы, дополняя их схемами и интересными примерами из клеточной патологии, связанной с медициной.
При подготовке материала данного учебника автор использовал учебник Ю. С. Ченцова «Введение в клеточную биологию» (2004), руководство для врачей Дж. М. Фаллер, Д. Шилдс «Молекулярная биология клетки» (2006). Была использована и классическая учебная литература: учебник Ю. С. Ченцова «Общая цитология» (1995) и трехтомное издание «Молекулярная биология клетки» (1994), подготовленное авторским коллективом Б. Албертс, Д. Брей, Дж. Льюис, М. Рэфф, К. Робертс, Дж. Уотсон. Глава, посвященная патологии клетки, написана с учетом научных данных, опубликованных в текущей научной литературе, но соответствующих устоявшимся представлениям.
Учебник иллюстрирован как собственными схемами и рисунками, так и иллюстративным материалом, взятым из изданий, указанных в специальном списке литературы.
Автор выражает глубокую благодарность профессору Ю. С. Ченцову за полезное обсуждение и ценные замечания.
Любая наука начинает активно развиваться, когда появляются методы, с помощью которых можно изучать необходимые объекты. Цитология есть наука о клетках – мельчайших живых структурах, имеющих обмен веществ и способных к размножению. Название «цитология» происходит от греческого слова kytos, что означает ячейка, клетка. У большинства организмов размеры клеток так малы, что их невозможно различить невооруженным глазом. Поэтому цитология начала развиваться с появлением и усовершенствованием световой микроскопии. Первые клетки наблюдал английский естествоиспытатель Роберт Гук в 1665 г. под микроскопом собственной конструкции. Это были клетки коры пробкового дуба. Первая книга, которая дает начало цитологии как науке о форме, структуре, функции и эволюции клеток, вышла в свет в 1884 г. Ее автор – Ж.-Б. Карнуа. Он назвал свою книгу «Биология клетки». Таким образом, начиная с первого описания клетки понадобилось больше 200 лет, прежде чем разрозненные знания о ней сложились в систему и дали начало новой науке – цитологии.
Современная цитология – это наука, которая изучает особенности строения, деления и жизнедеятельности клеток, присущие всем клеткам организма. Ученые также выделяют частную цитологию – эта наука изучает клетки конкретных тканей и органов в связи с уникальностью их функций.
Первые шаги в развитии новой науки сопровождались усовершенствованием светового микроскопа и развитием новых методов микротехники – приготовления окрашенных препаратов, на которых под микроскопом можно увидеть не только границы клетки, но и структуры внутри нее: ядро, живую протоплазму, хлоропласты, а также синцитий – структуру из делящихся клеток, соединенных цитоплазматическими мостиками, и изучить процессы деления клеток. Дав своей книге название «Биология клетки», Ж.-Б. Карнуа опередил время. Все чаще в современной биологии с конца XX в. употребляется именно такое название науки цитологии, которая является описательной морфологической наукой. Биология клетки – это современная экспериментальная наука, которая изучает физиологию клетки на молекулярном уровне, регуляцию ее работы, адаптацию к изменяющимся условиям окружающей среды. В основе биологии клетки лежат знания, полученные учеными-цитологами на протяжении полутора веков.
1665 г. – Р. Гук описал небольшие структуры в срезах коры пробкового дуба и назвал их клетками.
1674 г. – А. Левенгук открыл одноклеточные организмы, клеточный состав крови. Спустя 9 лет – увидел бактерии.
1833 г. – Р. Броун описал ядра в клетках орхидей.
1838 г. – Т. Шванн сформулировал клеточную теорию, используя обобщения М. Шлейдена о клеточном строении растений.
1846–1852 г. – Вводится термин «протоплазма» для обозначения тела живой клетки.
1855–1858 г. – Р. Вирхов установил, что клетки не могут образовываться из бесклеточного вещества, всякая клетка происходит только из клетки путем деления.
1876–1879 г. – Э. Страсбургером описана последовательность событий при делении растительных клеток.
1876 г. – Е. ван Бенеден открыл клеточный центр.
1879 г. – В. Флеминг ввел термины «митоз» и «хроматин», описал поведение хромосом в митозе животной клетки, хотя сам термин «хромосома» был предложен В. Вальдейером позднее, в 1888 г.
1875–1884 г. – Открыто, что при оплодотворении сливаются ядра половых клеток как у растений, так и у животных (Э. Страсбургер, Е. ван Бенеден, О. Гертвиг).
1882 г. – В. Флеминг открыл мейоз в клетках животных.
1888 г. – Э. Страсбургер описал мейоз в клетках растений.
1894 г. – Открытие биобластов Р. Альтманом, в 1897 г. эти структуры были названы митохондриями.
1898 г. – Открыт аппарат Гольджи итальянским ученым К. Гольджи.
В первой половине XX в. были описаны микротрубочки и эндоплазматический ретикулум, представляющий собой систему мелких вакуолей и канальцев.
Описанием клеточных структур цитология не заканчивается. После их описания с помощью световой микроскопии начинается изучение функций, проводится исследование сложных процессов деления и оплодотворения, выясняется биологическое значение этих процессов. Данные исследования проводятся с начала XX в., когда в цитологии начинают использоваться совершенно новые методы – культивирования клеток вне организма, цитохимии, а с середины XX в. – методы авторадиографии, фракционирования клеток и электронной микроскопии.
Вопросы
1. Почему цитология как наука начала активно развиваться только к концу XIX в.?
2. Назовите имена ученых, которые внесли значительный вклад в становление цитологии.
Размеры клеток имеют величины, выраженные в микрометрах (мкм). Средний размер животной клетки 20–40 мкм, растительные клетки обычно в 2 раза крупнее. Микрометр – это тысячная доля миллиметра, т. е. 1 мм = 1000 мкм. Большинство клеточных структур составляют десятые доли микрометра. Такие структуры можно увидеть только с помощью микроскопов.
Первые простейшие микроскопы были изобретены в конце XVI в. и представляли систему линз над предметным столиком. С помощью такого микроскопа нельзя было увидеть клетки, он не давал достаточного увеличения. В XVII в. микроскоп был усовершенствован, и с его помощью Р. Гук и А. ван Левенгук осуществляли свои наблюдения и открытия по клеточному строению коры дерева, крови, мужского эякулята, наличия одноклеточных существ в водном настое листьев сенны. В XVIII в. стали накапливаться данные о клеточном строении растений и некоторых животных. Клетки описывались как прозрачные ячейки, имеющие оболочку.
В начале XIX в. появляются зачатки микроскопической техники – способы приготовления тонких срезов тканей животных. Так, чешский исследователь Я. Пуркинье и его ученики разработали и использовали микротом для приготовления тонких срезов спинного мозга, мозжечка и других тканей, а также окраску срезов, в результате чего было описано живое содержимое клетки – протоплазма. Использование специальных красителей делает внутреннюю структуру клетки более контрастной, что позволило в 30-е годы XIX в. сформировать представление о наличии ядра в растительных и животных клетках.
Во второй половине XIX в. световой микроскоп был еще раз усовершенствован, изменена его конструкция. Освещение препарата стали производить снизу через систему линз конденсора. За счет применения объективов и окуляров повысилась разрешающая способность микроскопов, появилась возможность различать в клетке не только ядро и протоплазму, но и другие более мелкие структуры. Конструкция современных световых микроскопов, которые студенты используют на своих занятиях, мало чем отличается от усовершенствованных микроскопов второй половины XIX в.
Любой современный световой микроскоп имеет в своем составе три оптические системы, работающие совместно: конденсор, объектив и окуляр. Конденсор представляет собой систему линз, которые позволяют сфокусировать источник освещения и осветить объект снизу, чтобы лучи света проходили через тонкий срез. Конденсор имеет диафрагму, которая позволяет регулировать интенсивность освещения, делая его ярче или слабее.
Лучи света, пройдя через срез, фокусируются объективом. Именно объектив создает первичное увеличение объекта, дает его разрешение, позволяет увидеть мельчайшие структуры клетки. Окуляр увеличивает изображение, построенное объективом, и направляет его в глаз исследователя. Разрешение объекта остается таким, каким его сделал объектив. Общее увеличение объекта будет равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. На занятиях по цитологии чаще всего используется объектив с увеличением ×40 и окуляр, дающий увеличение в 15 раз, тогда общее увеличение будет 40×15. Нетрудно подсчитать, что это увеличение в 600 раз. Принято записывать увеличение препарата как 40×15; такая запись показывает разрешение объекта, какие детали должны быть выявлены на препарате, объектив с каким увеличением использовался для его анализа.
Световой микроскоп, как любой оптический прибор, имеет важную характеристику – разрешающую способность. Это минимальное расстояние между двумя точками, которые видны раздельно. Для современных световых микроскопов разрешающая способность равна 0,2 мкм, что соответствует средним размерам митохондрий. То есть под световым микроскопом при максимальном его разрешении митохондрии будут видны в виде точек с минимальными размерами. Примерно также будут выглядеть и многие другие органеллы цитоплазмы животной клетки. В растительной клетке есть более крупные структуры – хлоропласты и другие пластиды, размеры которых несколько микрометров.
Причиной того, что мелкие структуры клетки видны в световой микроскоп нечетко, является эффект оптической дифракции. В микроскопе яркая точка будет увеличена и выглядит как яркое пятно. Два близлежащих точечных объекта дают перекрывающиеся изображения пятен, которые сливаются в одно пятно.
Живые клетки бесцветны и прозрачны. Их показатель преломления близок к показателю преломления окружающего раствора. Поэтому неокрашенные клетки трудно рассматривать под микроскопом. В начале XIX в. ученые стали использовать цветные красители, которые делали клеточные структуры более контрастными и видимыми в световой микроскоп. Сейчас таких красителей множество. Некоторые из них преимущественно окрашивают определенные клеточные органеллы. Наиболее часто используемые красители для выявления общей морфологии клеток – это гематоксилин и эозин. Гематоксилин имеет сродство к отрицательно заряженным молекулам, поэтому выявляет распределение в клетках дезоксирибонуклеиновой кислоты и кислых белков. Обработка клеток гематоксилином приводит к выявлению структур ядра: хроматина, хромосом, ядрышка. Эти структуры окрашиваются в сине-фиолетовые цвета. После гематоксилина препарат помещают в раствор эозина, который окрашивает все остальные структуры клетки в розовый цвет. На розовом фоне цитоплазмы будет четко видна контрастная фиолетовая структура ядра.
Наибольшие успехи в описательной цитологии были достигнуты, когда в XIX в. научились делать постоянные, длительно хранящиеся окрашенные препараты клеток и тканей. Приготовление таких препаратов трудоемко и включает ряд этапов. Первый этап – взятие материала для исследования и фиксация небольшого кусочка ткани (0,5 см3). Цель этого процесса – быстро законсервировать клетки, но предотвратить распад клеточных структур. Чаще всего в качестве фиксаторов для световой микроскопии используют формалин, спирт, пикриновую кислоту, смеси формальдегида с этиловым спиртом, хотя известны сложные смеси многокомпонентных фиксаторов.
После фиксации из кусочка ткани нужно приготовить тонкие срезы толщиной 5–10 мкм на специальном приборе микротоме с помощью очень острого металлического ножа (лезвия). Чтобы срезы получились тонкими, кусочек ткани после фиксации обезвоживают с применением серии спиртов повышающейся концентрации и ксилола, затем пропитывают расплавленным парафином при 56ºС. При комнатной температуре парафин застывает, и кусочек ткани становится твердым, он готов для приготовления срезов.
Приготовленные срезы помещают на предметное стекло, растворяют парафин ксилолом, постепенно замещают ксилол водной средой с помощью растворов этилового спирта убывающей концентрации. Затем препарат окрашивают в водном растворе красителя. После окрашивания препарат опять обезвоживают и заключают в каплю канадского бальзама под покровное стекло. Такой препарат может храниться очень долго, на протяжении нескольких лет.
Совокупность приемов и методов приготовления и анализа с помощью световой микроскопии называется микротехникой.
В XX в. были разработаны световые микроскопы, позволяющие более детально изучать живые неокрашенные клетки. Это интерференционная микроскопия, поляризационная микроскопия, разнообразные приставки к обычному световому микроскопу – фазово-контрастная микроскопия и метод темного поля.
При изучении живых клеток широко используется люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия. В люминесцентном микроскопе объект освещается ультрафиолетовым лучом, используются особые красители – флюорохромы, которые при поглощении энергии света начинают ярко флюоресцировать. Флюорохромы могут избирательно связываться с определенными структурами клетки или макромолекулами. При таком микроскопировании светящиеся клеточные структуры выявляются на темном фоне. Разрешающая способность люминесцентного микроскопа такая же, как в световом.
Вопросы
1. Какой размер имеют клетки?
2. Перечислите компоненты микроскопа, задействованные в построении изображения. Какую функцию они выполняют?
3. Что такое разрешающая способность светового микроскопа?
4. Что такое микротехника?
5. Для чего используется фиксация? Приведите примеры фиксаторов.
6. Перечислите этапы приготовления постоянных препаратов.
